近年来，癌症已成为危害人类健康最主要的疾病之一。随着组学大数据及生物技术飞速发展，肿瘤精准医疗的概念也应运而生。肿瘤精准医疗主要在分子水平对易感癌基因的变化（原癌基因或抑癌基因发生的基因突变等）或生物标志物进行检测，利用所提供的生物指标和信息，进而达到个体化和预见性的治疗^[1]。在结肠癌患者中，经常可以检测到一种烷基化鸟嘌呤O6-carboxymethylguanine （O6-CMG），未来有望作为结肠癌的生物标志物。O6-CMG在人体中的含量与加工类（红）肉制品摄入量成正相关，它会引起G-A碱基颠换，导致基因的永久性改变^[2]。因此实现O6-CMG在基因上的精准定位十分重要，这将对人们进一步理解癌症机理，建立肿瘤诊断标志物等方面提供宝贵信息。

        然而目前还没有方法能够在基因层面实现O6-CMG的直接检测。纳米孔测序技术是新兴的单分子测序方法。原理上说，纳米孔测序技术可以在单分子水平直接读取DNA的碱基序列，且无需基因扩增，是检测修饰碱基最直接的方法^[3]。

        近日，本课题组与瑞士巴塞尔大学化学学院Dennis Gillingham教授课题组合作，利用纳米孔测序技术实现了对O6-CMG的高特异性直接检测。我们通过设计特殊的DNA模式序列，并用化学合成的手段在模式序列的不同位置引入一个或多个O6-CMG修饰碱基，进而在纳米孔测序过程中直接观测到了O6-CMG产生的特异性测序信号。O6-CMG在纳米孔测序中表现为极高的测序电流信号，与天然碱基信号显著区分，并借此实现O6-CMG在DNA序列中的精准定位。在所展示的实验数据中，O6-CMG的单次测序事件识别正确率可高达95%以上，三次重复测序即可达到99.9%以上的Consensus正确率。相较于传统方法而言，该方法具有单分子检测精度，保留了原始碱基上的官能团修饰，同时还能获取O6-CMG周围的碱基序列，是目前实现O6-CMG直接精准定位的唯一方法。

        在进一步的实验中，我们在单分子测序实验中意外发现O6-CMG会在单分子水平对phi29 DNA聚合酶产生复制阻碍，具体表现为奇异的动力学特征，这一现象或许可以解释在二代测序过程中出现的扩增偏见及测序盲区等问题。对酶动力学过程进一步挖掘，其中的酶动力学参数有望实现对一系列修饰碱基的深度区分，原则上可以实现对O6-CMG等一系列碱基损伤的100%精准分辨。

        该工作于2019年4月25日发表在Angewandte Chemie International Edition期刊。其中，本课题组硕士研究生王宇和瑞士巴塞尔大学化学学院博士后Kiran M. Patil为论文的共同第一作者，黄硕教授和Dennis Gillingham教授为论文的共同通讯作者，南京大学为第一通讯单位。

        近年来，本课题组在该研究领域有多项成果发表，包括开发了一种新型的纳米孔错位测序方法（nanopore-induced phase-shift sequencing, NIPSS, Chemical Science, 2019, 10(10): 3110-3117.）和新型光学纳米孔技术（Osmosis-Driven Motion-Type Modulation of Biological Nanopores for Parallel Optical Nucleic Acid Sensing. ACS applied materials & interfaces, 2018, 10(9): 7788-7797.），为纳米孔测序拓展更多应用出口。

        文章标题：Nanopore sequencing accurately identifies the mutagenic DNA lesion O6‐carboxymethyl guanine and reveals its behavior in replication ，DOI: 10.1002/anie.201902521（点击此处直达文章链接）

        该论文作者为：Yu Wang, Kiran M. Patil, Shuanghong Yan, Panke Zhang, Weiming Guo, Yuqin Wang, Hong-Yuan Chen, Dennis Gillingham, Shuo Huang.       

参考文献：

[1]    F. S. Collins, H. Varmus, N. Engl. J. Med. 2015, 372, 793-795.

[2]    M. H. Lewin, N. Bailey, T. Bandaletova, R. Bowman, A. J. Cross, J. Pollock, D. E. G. Shuker, S. A. Bingham, Cancer Research 2006, 66, 1859-1865.

[3]    E. A. Manrao, I. M. Derrington, A. H. Laszlo, K. W. Langford, M. K. Hopper, N. Gillgren, M. Pavlenok, M. Niederweis, J. H. Gundlach, Nat. Biotechnol. 2012, 30, 349-U174.