纳米孔技术起源于1996年，基于其极高的空间分辨率与较为直观的检测原理，纳米孔技术已经形成一个体系较为完整，功能独特的单分子生物物理学手段。纳米孔测序是纳米孔技术最重要的检测应用，也是最具代表性的单分子测序手段或第三代测序手段。纳米孔测序技术具备单分子分辨率，读长长，操作便携等独特优势。在宏基因组测序，病原体测序，新物种基因组测序与表观遗传学测序等多个具体的应用领域中渐渐展示出不可替代的地位。纳米孔测序除了可以独立进行测序操作外，亦常常与其它测序方法联用。

在一个典型的纳米孔测序实验中（图1左），纳米孔（粉色）是磷脂膜（灰色）两侧离子通过的唯一通道。测序酶（绿色）充当DNA的马达蛋白，拉动DNA链使其以单个核苷酸的步长依次通过纳米孔，每当一个核苷酸穿过纳米孔，相应的堵孔信号会被记录下来（图1右）。通过分析这些序列相关的电流信号，我们可以反推出DNA的序列。

图1：左）纳米孔测序机理；右）纳米孔测序事件（动图）

       基于本课题组在纳米孔测序技术上的掌握与创新，具体研究方向包括：1）新型纳米孔DNA测序方法；2）核酸修饰与碱基损伤的单分子测序研究；3）纳米孔错位测序方法NIPSS的研究。

• 新型纳米孔DNA测序方法

现今的纳米孔测序技术均依赖于生物酶来提供DNA过孔动力，但是测序酶本身会有回退、序列偏见等特性，这些特性不仅造成单次读取准确率不高，而且会大大增加后期数据处理的难度。除此之外，空间分辨率和测序通量不足也是限制纳米孔测序技术发展的两个重要方面。为了满足日益突出的科研和应用需求，一种基于更高空间分辨率纳米孔道的、无酶的、高通量的新型纳米孔测序方法必将被发展起来。

• 核酸修饰与碱基损伤的单分子测序研究

核酸修饰和碱基损伤不仅对基因表达、调控有重要作用，而且在肿瘤、免疫等许多疾病的发生和防治中亦有十分重要的意义。然而核酸修饰和碱基损伤经过序列扩增之后，检测信息都会消失，所以它们的直接检测必须依赖于无需核酸扩增的单分子检测手段进行表征，而纳米孔测序技术就是这样一种可以直接读出碱基修饰的技术，它使得探索碱基序列深层信息成为可能。

本课题组利用已经掌握的纳米孔测序技术，加上综合分析多种信号来源，已经可以以近乎零错误率的测序表现实现单条DNA序列上多个位置的碱基损伤识别与定位¹。图2是对烷基化碱基损伤O⁶-carboxymethylguanine（O⁶-CMG）的纳米孔检测，红色部分（图2右）是纳米孔测序过程中直接观测到的O⁶-CMG的特异信号。可以看到，O⁶-CMG在纳米孔测序中表现为极高的测序电流信号，与天然碱基信号明显区分，借此实现了高达95%准确率的O⁶-CMG的检测与精准定位。

•  纳米孔错位测序方法NIPSS的研究

纳米孔测序技术目前主要应用在DNA和RNA上，其他生物大分子（多肽、多糖、非天然核酸等）的纳米孔直接测序仍然面临着巨大挑战。除了这些生物大分子物化性质复杂外，出现这个现象更主要的原因是缺乏技术兼容的马达蛋白来提供测序动力。为了将纳米孔测序技术推向更多领域，并且巧妙地避开繁重耗时的马达蛋白筛选工作，本课题组自主开发出了一种新型的纳米孔错位测序方法（Nanopore-Induced Phase-Shift Sequencing，NIPSS）²。

以非天然核酸2’-deoxy-2’-fluoroarabinonucleic acid （FANA）为例（图3），通过构建FANA（链蓝色部分）与DNA（链灰色部分）的嵌合链，在DNA测序酶拉动DNA部分的同时，FANA也可以依次通过纳米孔而被读出（图3下）。                                

1. Wang, Yu, et al. "Nanopore sequencing accurately identifies the mutagenic DNA lesion O⁶‐carboxymethyl guanine and reveals its behavior in replication." Angewandte Chemie International Edition 58.25 (2019): 8432-8436.

2. Yan, Shuanghong, et al. "Direct sequencing of 2′-deoxy-2′-fluoroarabinonucleic acid (FANA) using nanopore-induced phase-shift sequencing (NIPSS)." Chemical science 10.10 (2019): 3110-3117.