纳米孔蛋白质组学（Nanopore Proteomics）

单通道纳米孔技术同样可作为蛋白质的分析工具。它的时间带宽可实现微秒级的时间分辨率和几十分钟的稳定检测，适合于蛋白质的动力学过程的实时解析。自2006年起纳米孔分析技术已经在蛋白质的浓度、形状、二级/三级结构，构象变化、翻译后修饰、展开动力学、扩散系数和配体结合动力学等过程的单分子观测中崭露头角（图1）。

图1. 左：纳米孔单蛋白质分析示意图；右：蛋白质产生的单分子电流阻塞事件。

然而基于生物纳米孔的蛋白质无标记传感目前仍处于发展阶段，特别是蛋白质的分子量范围分布广，尺寸各异，具有稳定的三维折叠结构且表面电荷分布不均，带电性质各不相同，这些问题都为通用的纳米孔蛋白质分析带来挑战。主流用于蛋白质分析的工程化生物纳米孔如ClyA、PlyAB通常具有较大的空腔容积，可以完全容纳待测蛋白，但它们在孔道组装、孔道测试稳定性等方面存在问题，限制了纳米孔在蛋白质组学方面的应用。另一方面，蛋白质的结构动力学产生的电流阻塞特征复杂多样，因此亟待扩展用来阻塞电流特征的参数种类，并开发更高效自动化的数据处理方法，避免人工处理造成的主观偏见。

本课题组利用锥型的耻垢分枝杆菌膜蛋白A（MspA）兼具大尺寸空腔和1.2 nm收缩区的结构优势，以“半阻孔”检测策略回避了改造整体结构宽大的生物纳米孔的需要，发掘出其传感折叠态蛋白质的能力，并开发出适配机器学习数据分析算法，为纳米孔蛋白质分析提供了分辨率更高、测试更稳定的传感方案。具体的研究进展包括：

Ÿ   基于MspA的蛋白质构象转换检测

我们首次将MspA应用于蛋白构象变化的无标记检测¹。选择钙调素（CaM）作为该策略的蛋白质模型，对其三种常规构象异构体、心肌病相关病理学突变体以及其他离子的替换对结构的影响进行了全面的实验表征研究（图2）。证明MspA纳米孔不仅可以用于DNA测序、单分子化学分析和纳米孔力谱等方面，在配体结合以及病理学突变诱导的蛋白构象变化的无标记检测方面也有巨大的应用潜力。MspA纳米孔对蛋白质具有高灵敏度、高分辨率和低检测限，可以有效弥补现有大尺寸生物孔道在表征蛋白质结构动力学方面的局限性。

图2. 左：使用MspA纳米孔监测钙调素构象转换示意图；右：三种构象产生的电流阻塞信号。

Ÿ   机器学习辅助的MspA电渗透势阱实现蛋白质高分辨识别

我们进一步开发了增强MspA势阱对蛋白质捕获能力的新方法，将KCl/CaCl₂不对称电解质缓冲液与MspA 检测系统相结合构建了电渗透(EOF)增强型纳米势阱²。实验中，MspA纳米孔对蛋白质的捕获效率提高7~18倍，分析时间延长最高达159倍，极大程度提高了MspA解析蛋白质的能力。使用该测试系统完成了蛋白质-辅酶和蛋白质-蛋白质相互作用前后的结构区分，并首次实现了四种不同带电性质的蛋白质的同时高分辨检测（图3）。

图3. 左：使用MspA电渗透势阱检测不同带电性质蛋白质；右：MspA电渗透势阱分析市售乳清蛋白营养粉成分。

为了更好描述蛋白质产生的阻孔电流特征，我们对传统数据分析方法进行了革新，使用人工智能自动提取电流的平均值、标准偏差、峰度、偏度、时间等7个参数组成蛋白质的指纹电流数据库，并以此构建基于机器学习分类模型的蛋白质自动分类系统（图4）。该系统可以进一步应用于市售乳清蛋白营养粉中ɑ-乳白蛋白和β-乳球蛋白的快速鉴定和定量，无需对样品进行任何预纯化处理。证明了该策略在从混合物中对蛋白质的快速、高灵敏检测和实时结构分析方面的具有非常好的应用前景，为纳米孔的蛋白质无标签直接分析提供了新的思路。

图4. 用于蛋白质自动识别的人工智能数据分析系统构建流程。左：分类模型训练过程；右：使用最优模型自动鉴定蛋白质混合物中组分。

该方向代表性论文

1.  Liu, Y.; Pan, T.; Wang, K.; Wang, Y.; Yan, S.; Wang, L.; Zhang, S.; Du, X.; Jia, W.; Zhang, P.; Chen, H.-Y.; Huang, S.*, Allosteric Switching of Calmodulin in a Mycobacterium smegmatis porin A (MspA) Nanopore-Trap. Angew. Chem. Int. Ed. 2021,60 (44), 23863-23870.

2.  Liu, Y.; Wang, K.; Wang, Y.; Wang, L.; Yan, S.; Du, X.; Zhang, P.; Chen, H.-Y.; Huang, S.*, Machine Learning Assisted Simultaneous Structural Profiling of Differently Charged Proteins in a Mycobacterium smegmatis Porin A (MspA) Electroosmotic Trap. J. Am. Chem. Soc. 2022,144 (2), 757-768.