纳米孔技术是一种简单高效的单分子分析方法，被广泛用于DNA测序，小分子传感，疾病诊断，药物筛选，环境检测等诸多领域，推动了生命分析，化学传感和精准医疗领域的进一步发展。该技术是依赖于膜片钳的单通道电流检测模式，受限于现有的微电子和微电极加工技术的技术门槛和成本限制，该技术在扩大通量的同时势必会牺牲其在设备尺寸和耗材成本上的优势。随着纳米孔测序技术产业化逐步展开，人们对超高通量纳米孔测序的需求愈发迫切，纳米孔成像技术由此诞生。

纳米孔荧光成像技术是一类以荧光显微成像为平台，有别于电生理测量的新型纳米孔分析方法。该技术通过荧光标记离子流或者分析物，对于任何一个空间位置独立的纳米孔道均能实现有效检测，实现实时高通量、可视化单通道纳米孔光学分析，获取多维度、多层次的单分子行为信息。自2009年被首次报道以来(J Am Chem Soc 2009, 131: 1652-1653)和一系列技术优化(Nat Nano 2015, 10: 986-991; ACS Appl Mater Inter 2018, 10: 7788-7797)，该方法已经被广泛应用于超灵敏小分子传感，高分辨核苷酸区分与特异性miRNA检测，理论检测密度可高达10⁴ pores/mm²，对于高通量纳米孔测序平台的实现意义深远。纳米孔成像是对现有的电生理为基础的纳米孔测量技术的有效拓展，尤其是在通量，便携性和检测成本方面具有非常巨大的产业化优势。不过与电生理纳米孔技术相比，纳米孔成像技术起步较晚、技术壁垒高，目前还处于研究展示阶段。

本课题组长期以来致力于该技术的概念推广、方法开发、装置优化、商业化生产和大规模应用。具体研究方向包括：1）基于共聚焦显微成像的超高时间分辨的光学纳米孔平行检测；2）基于芯片化的低成本光学纳米孔传感芯片阵列；3）光镊耦合的光学纳米孔测量；4）细胞内原位膜通道荧光分析。5）离子通道的空间定位，追踪与动力学分析。以下是课题组的近期进展：

⦁    高分辨纳米孔成像

      
图1：左). 纳米孔成像原理; 中). 单个α-HL纳米孔实时成像; 右). α-HL和ClyA-RR的同时成像与区分³ 

利用钙离子流荧光示踪，我们可以实现单个纳米孔分子的实时荧光成像（图1 左）。实验中，磷脂双分子层一侧的钙离子在电场的驱动下穿过纳米孔，与另一侧的钙离子荧光指示剂在孔口位置结合从而发射荧光。利用这个技术我们可以监测单个膜通道蛋白的空间位置、动力学信息和过孔离子流强度（图1 中）。该技术具有极高的空间和强度分辨率，可以显著区分纳米级尺寸差异的纳米孔（图1 右），适用于快速膜通道分析。

⦁    纳米孔示踪与固定

     
图2：左). 纳米孔的随机热运动; 右). 渗透压调制的纳米孔的固定²

利用荧光标记钙离子流的方法可以追踪单个纳米孔道在磷脂双分层上的二维热运动规律（图2 左）。实验中纳米孔的随机运动不利于光学信号的采集与分析，我们通过简单改变磷脂双分子层两侧的渗透压实现磷脂双分子层与基底之间相互作用的精准调节，从而提出了一种无需标记的生物膜孔道的运动学控制方法（图2 右）。该方法通用性强，不改变生物活性，可广泛应用于膜蛋白的单分子动力学研究、膜蛋白与脂质双分子层之间相互作用等研究领域。

⦁    高通量生物传感

图3：左). 实时高通量DNA传感;  中). 高通量RNA传感；右）高通量RNA传感对应的荧光曲线¹

与传统纳米孔检测原理类似，利用单个分子穿过纳米孔引起的荧光信号的变化可以用于解析该分子的结构和行为信息，实现高通量生物大分子传感（图3）。其理论检测密度高达104 pores/mm2, 是目前电生理纳米孔检测通量的1000倍，对于高通量DNA测序的实现意义深远。

⦁    无电极纳米孔技术               

 
图4：实时无电极ClyA纳米孔传感dsDNA³

通过检测荧光标记扩散驱动的过孔钙离子流，本课题组开创了首个无需电极的纳米孔单分子分析技术（DOP），并且成功运用于小分子，有机高聚物，生物大分子的单分子检测（图4）。这项技术启发于自然界自驱动的物质跨膜运输，不需要使用电极和膜片钳装置，利用膜两侧的浓度梯度驱动分析物与荧光标记的钙离子定向通过纳米孔，实现高分辨的单分子荧光传感。这项技术大幅度降低了仪器成本、装置体积和样品使用量，使得纳米孔检测技术朝着一起微型化，便携化，低成本化方向进一步发展，有望实现商业化纳米孔测序平台。

⦁    指尖型可抛弃式纳米孔检测芯片  

    
图5： 左). 指尖型检测芯片；右). 低成本检测平台³

无电极纳米孔技术大幅度简化了纳米孔实验装置，在此基础上我们，构建了高通量可抛弃式单分子分析芯片，该芯片仅需简单且无生物毒性的材料构成，现有芯片成本不足1美元，非常适用于临床检测中的可抛弃式检测需求，并有望进入日常生活。

该方向代表性论文：
1. S. Huang, M. Romero-Ruiz, O. K. Castell, H. Bayley, M. I. Wallace, High-throughput optical sensing of nucleic acids in a nanopore array. Nat Nano10, 986-991 (2015).
2. Y. Q. Wang, S. H. Yan, P. K. Zhang, Z. D. Zeng, D. Zhao, J. X. Wang, H. Y. Chen, S. Huang, Osmosis-Driven Motion-Type Modulation of Biological Nanopores for Parallel Optical Nucleic Acid Sensing. Acs Appl Mater Inter10, 7788-7797 (2018).
3. Y.Q. Wang, Y. Wang, X. Y. Du, S. H. Yan, P. K. Zhang, H. Y. Chen, S. Huang, Electrode-free Nanopore Sensing by DiffusiOptoPhysiology (DOP), Sci. Adv. 2019(just accepted, DOI: 10.1126/sciadv.aar3309)