核酸、蛋白质及糖类，是三种最重要的生物大分子，几乎参与了生命活动的所有过程。但是相较于核酸与蛋白质，糖类因为其繁多的单糖种类，复杂的立体化学信息以及十分相似的理化性质，其分析检测方法的发展速度尤为滞后。尽管美国国家科学院曾在2012年发布了一份题为《Transforming Glycoscience: A Roadmap for the Future》的报告，呼吁在未来需要大力发展糖科学领域的研究，但是10年时间过去了，不同种类单糖的直接区分甚至仍然存在一定挑战。因此，糖科学研究中迫切需要一种简单、快速、灵敏且准确的分析检测方法。

纳米孔检测技术作为20世纪90年代中期发展至今的一种分析手段，因为其无标记、高灵敏等优势，已经逐渐成为化学、生物学领域内一种重要的单分子级别的分析检测方法。更重要的是，基于纳米孔测序方法开发的第三代核酸测序技术已经被广泛的应用于生命科学研究中，纳米孔检测技术甚至可以在一定程度上实现蛋白质测序。这些结果无一不启发着我们亟待开发一种基于纳米孔的糖类分析方法。

在水溶液中，硼酸与糖类分子上顺式二醇的相互作用已经被广泛应用于糖类分析的研究中，因此，我们课题组开发了一种含有单个苯硼酸修饰的异质耻垢分枝杆菌膜蛋白A（MspA）孔道，并基于此实现了9种单糖的直接区分，区分准确率可以达到96%以上。MspA作为一种具有独特锥形结构的八聚体孔道蛋白，如何在其中引入单一位点突变的工作从未被报道。我们利用共表达的方法，成功构建了在孔道收缩区域含有单个半胱氨酸突变的(N90C)₁(M2)₇ MspA蛋白，这是纳米孔领域首次报道的异质MspA构建方案。随后，利用马来酰亚胺苯硼酸与孔道内单个巯基的迈克尔加成反应，构建了含有单个硼酸修饰的MspA-PBA蛋白。接下来我们尝试利用MspA-PBA传感了九种单糖，包括果糖、半乳糖、甘露糖、葡萄糖、山梨糖、核糖、木糖、L-鼠李糖和乙酰半乳糖胺，涵盖了五碳糖、六碳糖、脱氧糖等单糖类型，因为这些单糖在水溶液大部分都以吡喃糖和呋喃糖混合物的形式同时存在，每种单糖不同羟基与硼酸的结合模式汇报了多种信号类型（图1）。

图1 基于MspA-PBA的九种单糖传感

最后，为了能够快速准确的区分不同的单糖传感信号，我们开发了一种机器学习算法辅助单糖传感事件的自动识别。我们提取了每个糖传感事件的9个特征构建了特征矩阵，并在每种单糖传感事件的特征矩阵中随机选取1000个事件作为训练集评估了6种机器学习模型，随机森林模型对九种单糖的区分准确率可以达到96%以上，并且使用该模型可以快速判断九种单糖混合传感的每一个事件类型（图2）。上述结果都充分验证了基于MspA-PBA的单糖区分的潜力，为糖测序提供了新的可能。

图2 基于机器学习算法的九种单糖直接区分

该工作以“A Nanopore-Based Saccharide Sensor”为题，于2022年6月19日发表在《德国应用化学》（文章链接：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/anie.202203769，DOI：https://doi.org/10.1002/anie.202203769）本课题组博士生张善雨为该论文的第一作者，硕士生曹祯媛和博士生樊萍萍为等同贡献第一作者，黄硕教授为论文通讯作者。此项研究得到了生命分析化学国家重点实验室以及南京大学化学和生物医药创新研究院（ChemBIC）的重要支持，国家自然科学基金（项目编号：31972917，91753108，21675083）、中央高校基本科研业务费资助项目（项目编号：020514380257，020514380261）、江苏省高层次创业创新人才引进计划（个人、团体计划）、江苏省自然科学基金（项目编号：BK20200009）、南京大学生命科学分析化学国家重点实验室（项目编号：5431ZZXM1902）、南京大学科技创新基金资助项目、中国博士后科学基金资助项目（项目编号：2021M691508）等经费支持。