L-乳酸是许多生物在厌氧条件下糖酵解的最终代谢物。D-乳酸是L-乳酸的手性异构体，通常由胃肠道中的细菌产生，在体内被其他微生物转化。当胃肠道和肠道屏障功能受损时，体内会积累大量D-乳酸。多种生理和病理状况都与乳酸有关，血清中乳酸过多也可能导致高乳酸血症和乳酸酸中毒。D-葡萄糖是重要的生物代谢底物和能量供给。生物体内的葡萄糖水平与许多病理状况有关，包括癌症、糖尿病和肥胖。因此，同时分析血清乳酸和葡萄糖对疾病诊断和个人健康监测具有重要意义。特别地，对于糖尿病某些急性并发症引起的乳酸酸中毒的诊断，需要同时检测乳酸和葡萄糖水平。

上述分析物的传统检测方法依赖于相应的酶促反应。这些反应可能会产生相同的检测底物，例如同时传感D-葡萄糖和L-乳酸的氧化酶策略可能存在冲突。利用D-乳酸脱氢酶（D-LDH）对D-乳酸进行检测时，可能会受到内源性化合物如L-乳酸和丙酮酸的干扰。一些非酶促方法，如液相色谱串联质谱法（LC-MS/MS）和核酸适配体也被用于乳酸和葡萄糖的检测。然而，区分L-，D-乳酸仍需要额外的手性色谱。此外，LC-MS/MS的设备体积较大，并且需要专业人员进行操作。核酸适配体的检测分辨率和灵敏度不足，还需要额外的报告方法如荧光团等。因此，开发一种小型化、快速、经济的同时检测血清中L-，D-乳酸，D-葡萄糖的方法，将有利于相应的医学诊断或个人健康状况的日常监测。

此前，我们课题组基于原创开发的单个苯硼酸（PBA）修饰的异质耻垢分枝杆菌膜蛋白A（MspA）孔道（MspA-90PBA），成功实现了D-葡萄糖的检测，但该孔道技术尚未对血清等复杂生理样品进行检测。在本工作中，MspA-90PBA展现出优异的高分辨能力，能够同时完全分辨人类和动物血清中的L-，D-乳酸，D-葡萄糖和葡萄糖酸。整个分析过程简便快捷，不需要复杂的样品分离。将血清样本超滤处理后加入到测量装置中，即可产生连续的纳米孔事件。L-，D-乳酸，D-葡萄糖和葡萄糖酸中含有的顺式二醇部分，可以与MspA-90PBA的PBA接头形成可逆的硼酸酯，报告独特的纳米孔事件特征用于鉴定。结合定制的机器学习算法，可以精准和自动化识别血清中不同的目标分析物（图1）。这些结果证明了纳米孔传感器在医学诊断中的潜在应用，并可能为即时检测（POCT）设备的发展提供新思路。

图1. 血清的纳米孔分析流程

为了验证纳米孔分析血清样本的可行性，我们首先对真实血清样本中的L-乳酸进行了纳米孔鉴定。将商品化的标准人血清试剂超滤处理后加入到测量装置中，立即获得连续的纳米孔传感信号。通过纳米孔事件特征和机器学习算法，我们成功鉴定了人血清传感事件中的L-乳酸，事件的特征和分布与从标准品中获取的保持高度一致（图2）。由于MspA-90PBA具有高传感分辨率，血清中其他可以与PBA发生结合的分子汇报出了不同特征的结合事件，可以由机器学习算法自动识别和去除。

图2. 人血清中L-乳酸的纳米孔鉴定

为了展示该技术同时鉴定L-，D-乳酸和D-葡萄糖的分辨率，我们进一步在标准人血清中添加了D-乳酸和D-葡萄糖。这种特殊制备的人血清样品与上述样品保持相同的预处理和测量方法。通过定制的机器学习算法，可以清楚地看到该样品中L-，D-乳酸和D-葡萄糖的纳米孔事件。上述所有化合物都具有高度可区分的事件特征，因此可以在同一系统中进行同时分析（图3）。L-，D-乳酸的纳米孔鉴定不需要样品分离，相较于传统分析方法更加简单。

图3. 同时鉴定血清中的L-，D-乳酸和D-葡萄糖

上述针对人血清的纳米孔分析方法原则上也适用于动物血清的分析。为了证明其可行性，我们选择了不同的动物血清进行测试（图4）。在鸡血清中发现了一种以前未识别的事件类型，通过文献调研和事件特征比较，这种新发现的事件类型被证实是葡萄糖酸。葡萄糖酸通过调节胃肠道的pH值，有利于维持各种消化酶的活性。在养殖业中，它通常用作饲料添加剂或由饲料中添加的葡萄糖氧化酶而生产。此外，不同动物血清的L-，D-乳酸，D-葡萄糖和葡萄糖酸的水平显着不同。由于PBA适配器的高分辨率和选择性，该系统可直接用于人类和不同动物的血清分析，表明其在乳酸酸中毒、糖尿病和糖尿病性乳酸酸中毒等疾病的诊断，以及在农业科学或养殖业中的应用潜力。

图4. 动物血清的纳米孔分析

该工作以“Nanopore Identification of L-, D-Lactic Acids, D-Glucose and Gluconic Acid in the Serum of Human and Animals”为题，于2024年6月12日发表在 《Small Methods》（文章链接： https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/smtd.202400664，DOI：10.1002/smtd.202400664）。本课题组博士后贾文东为该论文的第一作者，硕士研究生欧阳羽升为共同第一作者，黄硕教授为论文通讯作者。此项研究得到了生命分析化学国家重点实验室以及南京大学化学和生物医药创新研究院（ChemBIC）的重要支持，国家自然科学基金（项目编号：22225405，31972917）、科技部国家重点研发计划课题（项目编号：2022YFA1304602）中央高校基本科研业务费资助项目（项目编号：020514380257）、江苏省高层次创业创新人才引进计划（个人、团体计划）、江苏省自然科学基金（项目编号：BK20200009）、南京大学卓越计划（项目编号：ZYJH004）、中国博士后科学基金（项目编号：2022M721554，2023T160300）、江苏省卓越博士后计划（项目编号：2023ZB643）等经费支持。