如果化学反应不再只是平均意义上的“速率常数”和“反应产率”，而是可以被逐个分子地直接观察，它会呈现出怎样的面貌？近日，黄硕教授与苏州大学刘瑶副教授合作在生物物理学领域权威综述期刊《Annual Review of Biophysics》发表了综述文章“Nanopore Single-Molecule Chemistry”，为这一问题给出了清晰而系统的回答。文章系统总结了纳米孔单分子化学这一新兴交叉领域的发展脉络，展示了纳米孔技术如何从分子传感工具演变为解析化学反应的单分子实验平台。

纳米孔技术最初源于对天然离子通道蛋白的研究。通过将蛋白孔道嵌入脂质双层膜中，研究者可以在外加电场下记录离子通过孔道产生的电流变化。当分子进入孔道时，离子流被部分阻挡，从而留下可被记录的电信号。正是这种无需标记、实时响应的特性，使纳米孔在核酸测序领域迅速崭露头角。然而，传统纳米孔主要依赖分子尺寸和体积差异进行区分，对于尺寸相近的小分子、同分异构体乃至手性分子，分辨能力始终受限。纳米孔单分子化学的突破，在于将“化学反应”本身引入孔道之中。通过在纳米孔腔内精确布置具有反应活性的功能基团，目标分子可在纳米限域空间中发生配位、共价或特异性非共价相互作用。这些反应过程会以离子电流的形式被实时记录，使单个分子的结合、解离、构象变化乃至反应中间体都变得清晰可辨。此时，纳米孔不再只是通道或传感器，而是一个真正意义上的单分子“纳米反应器”。

综述回顾了纳米孔工程策略的系统演进过程，从利用天然氨基酸侧链反应性，到引入非天然氨基酸和化学修饰模块，研究者不断扩展纳米孔可解析的化学反应类型，使金属配位、硫醇交换、生物正交反应以及多步催化过程得以在单分子层面被直接观测。纳米限域效应不仅放大了反应差异，也为捕捉体相实验中难以观测的瞬态中间体提供了独特窗口。综述重点阐述了纳米孔单分子化学领域的一个关键技术瓶颈和解决方案，即如何在纳米孔内实现精准的“一对一”反应。天然蛋白纳米孔多为同源多聚体的自组装结构，意味着常规蛋白质工程方法将引入多个相同的反应位点，容易导致信号混叠，难以拆分解析。为此，研究者发展了多种控制策略，包括构建只含单一反应位点的异源多聚体纳米孔，或将反应中心转移到可编程的分子适配体上。这种设计确保了孔道内仅存在唯一的反应位点，消除了信号干扰，显著提升了数据可解释性，也为后续的定量分析和复杂样品检测奠定了基础。

当纳米孔实验逐渐从实验室级别的标准样本走向生物流体或环境样本，数据处理成为新的挑战。单分子电流信号往往具有随机性强、特征维度高的特点，传统的人工筛选和经验判断已难以满足需求。综述指出，机器学习方法的引入正在深刻改变这一领域。从事件识别、特征提取到分类与聚类，利用统计学习和人工智能算法可以建立一套从“数据清洗”到“智能识别”的完整工作流，显著提升了分析效率和客观性，使纳米孔能够借助单分子化学反应对真实样品中的多组分体系进行快速、自动化解析。由此，纳米孔技术正在从精密的分析化学实验工具，逐步演化为面向食品、药品、工业用品、临床样品等实际需求的分析平台。

在展望部分，综述强调了纳米孔单分子化学在未来应用中的巨大潜力。无论是疾病相关代谢物的精准检测，复杂天然样品的快速成分分析，还是对限域条件下化学反应新规律的探索，这一技术都展现出独特优势。随着分子动力学模拟、人工智能驱动的蛋白设计以及微纳系统工程的进一步融合，纳米孔传感器的设计将更加理性与高效，有望覆盖更广泛的化学空间并不断降低实验与应用门槛。这不仅将推动对限域条件下化学反应新规律的基础探索，也将加速纳米孔单分子化学技术在精准医疗与痕量分析领域的实际应用进程。

该综述于2026年1月15日发表在《Annual Review of Biophysics》（论文链接：https://doi.org/10.1146/annurev-biophys-021424-125106），苏州大学刘瑶副教授（本课题组2022届博士）为该论文的第一作者，并与南京大学黄硕教授共同作为该论文的通讯作者。这项工作得到了科技部国家重点研发计划（项目编号：2022YFA1304602）、国家自然科学基金（项目编号：22225405）、中央高校基本科研业务费（项目编号：020514380336）和生命分析化学全国重点实验室（项目编号：5431ZZXM2509）等经费的支持。