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Chemical Science 报道本课题组工作:非天然核酸FANA的纳米孔直接测序方法

发布时间:2019-01-24 

        非天然核酸(xeno-nucleic acid,XNA)是一类具有非天然骨架或核酸碱基的核酸分子。由于其极高的化学多样性和生物稳定性,XNA已经在分子医学、合成生物学和材料科学中表现出令人振奋的应用 [1-3]。与DNA和RNA类似,所有非天然核酸的功能特性都是由其序列决定的。但是,由于缺乏合适的聚合酶能与当前测序技术兼容,XNA的序列无法由现有测序手段直接读取,科研工作者只能先将非天然核酸逆转录成cDNA,再通过对cDNA测序来逆推XNA的序列。但是这种间接测序的方法会不可避免的忽略逆转录非天然核酸过程中引入的错误。对非天然核酸实现高精度的直接测序将为合成基因领域提供宝贵的信息。

       2'-deoxy-2'-fluoroarabinonucleic acid(FANA)是一种特定的XNA,具有和RNA类似的结构,糖环的2'被F原子取代。现有报道证明,FANA具有强大的基因沉默能力和更长的血清半衰期  [4,5]。最近聚合酶工程的进展也使得具有特定配体结合和催化活性的功能性FANA分子在体外进化成为可能。虽然已报道的D4K和RT521这两种工程酶可以催化FANA与DNA之间的高效转化,但是由于缺乏直接的FANA测序技术,这种酶介导的聚合反应的保真度还没有得到彻底地检测。尽管有着迫切的需求,但是现有的测序平台还不能实现FANA的直接测序。

       纳米孔测序技术是一种直接根据核酸的理化性质进行碱基识别的新型测序技术。同时,该技术能精确读出碱基的特定化学修饰,从原理上是理想的非天然核酸直接测序技术。

       近日,我课题组黄硕教授与现代工程与应用科学学院于涵洋教授合作,报道了一种新型的纳米孔错位测序方法(nanopore-induced phase-shift sequencing, NIPSS),并借此方法对FANA实现了直接测序。作为概念性验证,我们先将不同的FANA均聚物使用链霉亲和素固定的方法进行纳米孔静态检测 [6],发现FANA polyA、polyU、polyC造成的电流堵塞信号具有明显区分,这是纳米孔技术能够对FANA进行测序的可行性前提(图1)。使用纳米孔进行核酸测序时,提供纳米孔测序驱动力的phi29 DNA聚合酶(phi29 DNAP)与纳米孔识别位点处之间的距离始终保持在14-15个核苷酸的长度 [7]。正是利用这段错位距离,作者进而设计了FANA与DNA的嵌合链,当聚合酶拉动DNA在纳米孔中移动时,由于孔道的错位效应,FANA链会依次通过纳米孔识别位点,从而直接读出FANA的序列信息(图2)。此外,在该课题的研究过程中,phi29 DNAP亦被意外发现是一种可在常温下工作的FANA逆转录酶。通过对phi29 DNAP的进一步酶工程改造,有望实现更长读长的FANA直接纳米孔测序。

图1. 不同FANA均聚物产生的堵塞电流信号有明显区分。

图2. 使用纳米孔错位测序法进行FANA-DNA嵌合链的直接测序。

       该研究巧妙地利用纳米孔测序技术中的错位效应,使得纳米孔测序技术在更多领域实现了前所未有的可能性。除了FANA的直接测序,NIPSS还可作为XNA的通用测序方法,甚至任何可以与DNA连接的生物大分子都可以使用NIPSS进行直接。另外,通过提高纳米孔的绝对高度,或是对测序酶进行蛋白工程的优化,有望于实现XNA的全长测序,推动非天然核酸领域与纳米孔领域的共同发展。

       该工作发表在Chemical Science 期刊。其中,本课题组博士生阎双红和南京大学现代工程与应用科学学院李欣彤为论文的共同第一作者,于涵洋教授和黄硕教授为论文的共同通讯作者。

       文章标题:Direct sequencing of 2'-deoxy-2'-fluoroarabinonucleic acid (FANA) using nanopore-induced phase-shift sequencing (NIPSS),Chem. Sci., 2019, DOI: 10.1039/C8SC05228J (点击此处直达文章链接)

       该论文作者为:Shuanghong Yan, Xintong Li, Panke Zhang, Yuqin Wang, Hong-Yuan Chen, Shuo Huang and Hanyang Yu 

 

参考文献:

  1. A. I. Taylor, S. Arangundy-Franklin and P. Holliger, Curr. Opin. Chem. Biol., 2014, 22, 79–84.

  2. A. W. Feldmann and F. E. Romesberg, Acc. Chem. Res., 2018, 51, 394–403.

  3. V. B. Pinheiro and P. Holliger, Trends Biotechnol., 2014, 32, 321–328.

  4. T. Dowler, D. Bergeron, A. L. Tedeschi, L. Paquet, N. Ferrari and M. J. Damha, Nucleic Acids Res., 2006, 34, 1669–1675.

  5. T. Dowler, D. Bergeron, A. L. Tedeschi, L. Paquet, N. Ferrari and M. J. Damha, Nucleic Acids Res., 2006, 34, 1669–1675.

  6. E. A. Manrao, I. M. Derrington, M. Pavlenok, M. Niederweis and J. H. Gundlach, PLoS One, 2011, 6, e25723.

  7. E. A. Manrao, I. M. Derrington, A. H. Laszlo, K. W. Langford, M. K. Hopper, N. Gillgren, M. Pavlenok, M. Niederweis and J. H. Gundlach, Nat. Biotechnol., 2012, 30, 349–353.

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