DNA在内源性或外源性因素的持续攻击下形成的异常结构被称为DNA损伤。人体中的DNA损伤与衰老、神经退行性疾病、肿瘤等密切相关，绘制DNA损伤在基因组中的分布对于深入解读其致病机制、研究DNA损伤修复耐受性、开发癌症诊疗策略、评估抗肿瘤药物疗效等方面均有着深远意义。然而，目前测序DNA损伤的工具十分匮乏，由于DNA损伤的致突变以及复制阻滞特性，其信息难以通过二代测序技术读取。面对类型多样的DNA损伤，目前仅有极少数的DNA损伤借助二代测序与抗体富集/化学标记相结合的方法实现了测序，且难以避免抗体或化学标记策略特异性不足的问题，从原理上讲，通过二代测序实现DNA中不同DNA损伤的同时表征也是极为困难的。因此，引入新的DNA损伤测序方法对于推动DNA损伤相关的基础研究以及疾病诊疗方案的开发而言十分重要。

纳米孔测序作为第三代单分子测序技术，具有直接测序核酸的技术优势，在直接表征广泛的核酸序列修饰或损伤方面极具潜力。然而，常规的纳米孔测序分析（图1A, Detection mode I）会发生测序错误，如对于目标修饰碱基的分辨率不足或检测受其序列环境干扰而产生错读，以及目标碱基过孔速度太快而造成漏检。

近日，我们开发了一种新型通过在纳米孔测序中监测聚合酶阻滞动力学的DNA损伤测序方法（图1 A, Detection mode II），利用单分子水平上DNA损伤与聚合酶活性位点间相互作用汇报出的酶阻滞动力学特征，成功实现了三种烷基化试剂诱导形成的致突变性与致癌性DNA损伤O⁶-羧甲基鸟苷（O⁶-carboxymethylguanosine，O⁶-CMG）、O⁶-甲基鸟苷（O⁶-methylguanosine，O⁶-MeG）与无碱基位点（abasic site, AP site）的准确区分（图1B）。并且，这一方法也为常规纳米孔测序中出现的测序错误提供了解决方案。

 图1. 通过在纳米孔测序中监测聚合酶阻滞动力学区分DNA损伤的概念演示。 

我们首先对包含O⁶-CMG损伤的模型DNA（DNA1）进行测试，在其纳米孔测序事件中观察到了具有高度一致性的聚合酶阻滞信号，表现为两个重复的电流平台之间的持续波动（图2A）。根据从测序事件中绘制的酶沿DNA模板位置移动的轨迹，揭示出聚合酶在DNA损伤位点发生了阻滞，这种现象在全部由规范碱基组成的对照DNA中从未出现，证实其来源于DNA损伤（图2B）。聚合酶阻滞显著延长了DNA碱基损伤通过孔道的总体时间，有助于规避在纳米孔测序中因目标碱基损伤太快通过孔道而产生漏检的测序错误。我们进一步提取DNA碱基损伤位点产生的停留时间样本用于聚合酶阻滞动力学特征分析，结果显示，O⁶-CMG会导致超低速、高速两种截然不同的聚合酶运动模式，且报告的酶动力学特征在纳米孔识别位点读取序列或DNA损伤邻近序列环境改变时，依然具有一致性（图2C-D）。这一结果说明单分子聚合酶阻滞动力学能为DNA碱基损伤提供可靠的、不易受序列环境干扰的检测指标，不同于受目标修饰碱基周围序列影响而产生测序错误的常规纳米孔测序读取，酶动力学特征可能有助于检测未知序列环境中的DNA损伤或修饰。最后，我们论证了这种策略同样适合于识别O⁶-MeG和AP site损伤，O⁶-CMG、O⁶-MeG和AP site三种DNA损伤能够通过各自的单分子酶阻滞动力学特征实现准确区分（图2E），而标准纳米孔测序会造成O⁶-MeG的误读，且难以区分O⁶-CMG和AP site（图3），充分验证了酶阻滞动力学策略用于DNA损伤检测的可行性及检测能力。­

图2. 利用单分子聚合酶阻滞动力学鉴定DNA损伤。

 图3. 利用常规纳米孔测序分析鉴定DNA损伤。 

在纳米孔测序中利用聚合酶阻滞动力学为鉴定DNA损伤或修饰提供了新的策略，这种优势的方法同样适用于检测其他类型的具有聚合酶阻滞效应的DNA碱基损伤，在未来有望用于助力DNA损伤相关的机制解读以及生物医学研究。同时，它也为研究DNA损伤与酶之间的相互作用提供了一种新型高分辨率的单分子测量工具。

该工作以“Discrimination between Different DNA Lesions by Monitoring Single-Molecule Polymerase Stalling Kinetics during Nanopore Sequencing”为题，于2022年6月17日发表于《Nano letters》（文章链接：https://pubs.acs.org/doi/full/10.1021/acs.nanolett.2c01833，DOI: 10.1021/acs.nanolett.2c01833）。本课题组博士生张金月与硕士生王宇为论文的共同第一作者，黄硕教授为论文的通讯作者，陈洪渊院士对该工作做出了重要指导。此项研究得到了国家自然科学基金（项目编号：31972917，91753108，21675083）、江苏省自然科学基金（项目编号：BK20200009）、南京大学生命科学分析化学国家重点实验室（项目编号：5431ZZXM1902）等经费支持。