核糖核苷酸广泛存在于所有生物体内，行使着丰富的生物学功能。他们是RNA的基本组成单元，还可以充当能量载体、化学信使、辅酶因子或治疗靶点，对许多生命过程至关重要。核糖核苷酸结构相似，由一分子含氮碱基、一分子核糖和一分子磷酸组成。根据磷酸的数目不同，常见的核糖核苷酸包括核苷单磷酸、二磷酸和三磷酸。天然的核糖核苷酸也可以在不同的磷酸化形式之间动态切换，给其传感带来了巨大的挑战。

传统的分离技术，如毛细管电泳，薄层色谱和液相色谱的各种分离技术已经用于核糖核苷酸的鉴定。其中，最常用的是液相色谱，如阴离子交换色谱，离子对色谱，或亲水性相互作用色谱，因为该技术对分析物的电荷和大小具有很高的敏感性(1)。然而，核糖核苷酸的充分分离往往需要精细地优化各种色谱条件，包括不同的固定相、添加剂、流速、柱温、流动相的梯度以及浓度和pH等。此外，这些液相色谱技术往往需要与紫外或质谱耦合，以避免定量误差(1)。

纳米孔是一类单分子传感器，最初开发用于核酸测序。通过对孔道进行工程化改造，纳米孔也可以作为单分子反应器，以高分辨率识别各种相似的小分子。异质纳米孔道技术是近年来由我们课题组原创开发的一种用于小分子检测的通用策略。该技术在天然的耻垢分枝杆菌膜蛋白A (MspA) 纳米孔的八个均聚单体中引入了一条含定点突变的单体，实现了异质MspA的构建。利用该技术，本课题组实现了RNA表观遗传学修饰、单糖和糖醇的检测(2-4)。在此基础上，我们课题组近日在ACS Nano 上报道了利用异质MspA实现核苷单磷酸、二磷酸和三磷酸的单分子区分。我们在异质MspA纳米孔内通过迈克尔加成反应引入了单一的苯硼酸分子。利用苯硼酸和核苷酸上顺式二醇的可逆相互作用，我们实现了十二种核糖核苷酸，包括胞苷、尿苷、腺苷和鸟苷的单磷酸、二磷酸和三磷酸的同时检测。在机器学习算法的辅助下，核糖核苷酸的识别准确率达到了99.9%。

图1：苯硼酸内嵌的MspA纳米孔区分核苷单磷酸、二磷酸和三磷酸

天然核糖核苷酸作为人体必需的营养素广泛应用于制药行业。例如，ATP是治疗代谢紊乱和肌肉萎缩的一种重要临床药物，也是治疗慢性肝炎、冠心病、肾炎、脑动脉硬化的辅助药物。利用异质纳米孔技术，我们成功在商用的ATP药物中检测到了微量的ADP和AMP杂质。该方法不需要复杂的样品预处理，同时具有较高的灵敏度和准确度。这表明这种传感策略能够直接鉴定混合物中不同磷酸化的核苷酸，为细胞内核苷酸代谢、核苷酸参与的酶促反应以及食品、药品中外源性核苷酸的快速检测提供了单分子分析工具。

图2：ATP药物中核糖核苷酸的快速鉴定

该工作以“Discrimination of Ribonucleoside Mono-, Di-, and Triphosphates Using an Engineered Nanopore”为题，于2022年12月7日发表在《ACS Nano》（DOI：10.1021/acsnano.2c09662，文章链接：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acsnano.2c09662）。本课题组博士后王玉琴、博士生樊萍萍为该论文共同第一作者，黄硕教授为论文通讯作者。此项研究得到了生命分析化学国家重点实验室以及南京大学化学和生物医药创新研究院（ChemBIC）的重要支持，国家自然科学基金（项目编号：22225405和31972917）、中央高校基本科研业务费资助项目（项目编号：020514380257）、江苏省高层次创业创新人才引进计划（个人、团体计划）、江苏省自然科学基金（项目编号：BK20200009）、南京大学优秀科研项目（项目编号：ZYJH004）、上海市市级科技重大专项、南京大学生命科学分析化学国家重点实验室（项目编号：5431ZZXM1902）、中国博士后科学基金资助项目（项目编号：2021M691508, 2022M721554和2022T150308）等经费支持。