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Chemical Science报道本课题组工作: 无需高端仪器和研究基础即可快速制备多种MspA纳米孔突变体

发布时间:2021-06-08 

耻垢分枝杆菌孔蛋白AMspA是第一个展示了直接纳米孔测序的纳米孔1,2,是常用的生物纳米孔之一。得益于其特有的锥形结构,近年来纳米孔单分子化学的发展也表明MspA是一种理想的单分子化学反应器3,4MspA进行工程化改造可以赋予其多样化的传感能力。然而,以蛋白为本质的生物纳米孔的制备需要耗费大量的工作量。因此,迫切需要一种快速和多组分的孔道制备与筛选方法。因此,制备MspA的方法应该极尽简单,且应具备方便同时大规模制备的多组分形式。

最早的MspA制备方法是通过使用有机溶剂直接从培养的耻垢分枝杆菌菌株中提取全细胞来进行制备5,但是这种方法最终得到的产率极低,且在下游纳米孔测量中可能出现其他非靶标通道蛋白的干扰。此外,作为一种重组蛋白,MspA也可由大肠杆菌表达,随后通过阴离子交换色谱法6或镍亲核色谱法3,4进行纯化,这种策略需要使用快速蛋白液相色谱(FPLC)仪。尽管可以达到很高的纯度,但同时也受限于仪器的极低通量。当需要制备多种MspA突变体时,需要大量的人力劳动以及时间成本。高效液相色谱仪价格不菲,且需要对非专业人员进行大量的培训。考虑到MspA还未商业化,对大多数的研究团体而言,MspA的制备仍是一个技术障碍。

近日,我们课题组报道了一种快速、多组分的MspA纳米孔的制备方法(图1)。利用MspA所具备的极佳的热稳定性7,在纯化之前对含有MspA的重悬细胞进行了彻底的加热,这可以更有效地裂解细胞以提高产量,同时也省去了超声仪器的使用。并且,加热的处理也同时有效地消除了那些不具备热稳定性的杂质蛋白。随后,借助MspAC端带有的His标签与Ni2+的相互作用,我们选择了使用带镍的磁珠进行纯化,整个过程只有加样、震荡以及磁分离等极为简单的操作。虽然通过该方法最终得到的MspA纳米孔仍然可能含有少许杂质蛋白,但是后续纳米孔测量实验表明,这些杂质蛋白不会像MspA一样插入膜中,并不会对后续的单分子实验产生干扰。整个过程操作极其简单,无需高昂仪器设备(单批MspA的制备成本不到0.4美金),仅需人工操作40分钟即可同时获得多种MspA蛋白突变体。

1.MspA的快速、多组分制备流程

2. M2 MspA在DNA测序方面的应用

为了验证该方法制备出的孔道质量,这些同时制备的MspA突变体分别在相应的单分子测量中进行了测试。在纳米孔测序实验中,利用M2 MspA对合成的单链DNAAGAATGTT5’-3’,六个序列重复的片段)进行测序。实验结果与预期相吻合,可以清楚的观察到六个三角形的纳米孔测序图案(图2)。此外,我们还通过全内反射荧光(TIRF)显微镜对液滴界面双层(DIBs)进行荧光成像,可以观察到自发插入其中的M2 MspA随着施加电压的改变而闪烁,从其中的一个MspA纳米孔中提取的荧光-时间轨迹也与施加的方波电压同步变化(图3)。经过工程化改造的其余3MspA突变体也完美地观察到了各自的单分子化学反应(图4)。总而言之,通过此方法得到的所有MspA孔道蛋白均满足单分子实验的需求,该方法在保证孔道质量的前提下,大大简化了制备流程。


图3. M2 MspA随着电压改变而闪烁


图4. 不同MspA突变体观测到的单分子化学反应

该方法对筛选新的MspA突变体非常有利,这在进一步研究新的MspA纳米反应器时是迫切需要的。该方法的简单性和低成本也是MspA突变体的工业制备或纳米孔制备投资预算有限的小型学术团体的理想选择。理论上,该方法也同样适用于其它带有His标签且具有热稳定性的蛋白。

该工作以“Rapid and multiplex preparation of engineered Mycobacterium smegmatis porin A (MspA) nanopores for single molecule sensing and sequencing”为题,于202168日在《Chemical Science》发表相关论文(DOI10.1039/D1SC01399H,文章链接:https://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/2021/sc/d1sc01399h#!divAbstract)。黄硕教授为该论文的通讯作者,本课题组博士生阎双红与硕士生王栎荧为该论文的共同第一作者。

 


 

参考文献:

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2. A. H. Laszlo, I. M. Derrington, B. C. Ross, H. Brinkerhoff, A. Adey, I. C. Nova, J. M. Craig, K. W. Langford, J. M. Samson, R. Daza, K. Doering, J. Shendure and J. H. Gundlach, Nat. Biotechnol., 2014, 32, 829-833.

3. J. Cao, W. Jia, J. Zhang, X. Xu, S. Yan, Y. Wang, P. Zhang, H.-Y. Chen and S. Huang, Nat. Commun., 2019, 10, 5668-5678.

4. S. Wang, J. Cao, W. Jia, W. Guo, S. Yan, Y. Wang, P. Zhang, H.-Y. Chen and S. Huang, Chem. Sci., 2020, 11, 879-887.

5. M. Niederweis, S. Ehrt, C. Heinz, U. Klöcker, S. Karosi, K. M. Swiderek, L. W. Riley and R. Benz, Mol. Microbiol., 1999, 33, 933-945.

6. C. Heinz, S. Karosi and M. Niederweis, J. Chromatogr. B, 2003, 790, 337-348.

7. C. Heinz, H. Engelhardt and M. Niederweis, J. Biol. Chem., 2003, 278, 8678-8685.


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