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iScience 报道本课题组工作: 纳米孔错位测序方法NIPSS首次实现microRNA的单分子直接测序

发布时间:2020-02-14 

MicroRNA (miRNA) 是一类长度约为22个核苷酸(22 nt)的非编码小分子RNA,其短序列中蕴藏着丰富的功能信息,几乎涉及了生命过程的方方面面,如生长发育、新陈代谢、病毒感染、免疫反应以及肿瘤的发生转移等等(Kim et al., 2018)MiRNA通过碱基互补配对作用靶向mRNA,调控基因表达进而实现这些功能。这一过程中,除了包含A、U、C、G四种经典碱基的序列组合,存在于miRNA上的碱基修饰也发挥着重要的作用。已有研究证明,存在于miRNAm6A修饰可以影响miRNA的生物合成过程(Alarcon et al., 2015),并且,其修饰水平的紊乱与胃肠癌密切相关(Konno et al., 2019)。因此,通过对单个miRNA分子直接测序来破译miRNA的序列及修饰信息,可以为理解生命过程及癌症的诊疗提供宝贵的信息。

由于miRNA自身长度极短,现有技术还不能在单分子水平上直接读取miRNA序列。常规的miRNA测序方法仍然需要逆转录后扩增的方法间接实现测序。然而,miRNA的修饰信息会在测序过程中因反转录和扩增而丢失,miRNA的直接测序仍是困扰研究者的一大难题,不利于通过测序精准定位miRNA上的核酸修饰信息,且从原理上无法对单个miRNA片段上的多种核酸修饰同时进行测序分析。纳米孔测序技术作为新兴的单分子测序技术,无需扩增,可以根据碱基自身的理化性质来读取核酸序列,是最直接的核酸测序检测方法。然而,现有纳米孔测序技术更多关注于长读长的基因组或转录组的直接测序,对于极短的非编码RNA的直接测序还没有相关报道。在技术层面上,现有纳米孔测序平台亦不适用于分析诸如miRNA在内的极短非编码RNA

近日,本团队借助新近研发的纳米孔错位测序技术(Nanopore Induced Phase-shift Sequencing, NIPSS),首次实现了miRNA的直接单分子测序,miRNA的序列及修饰信息亦可在测序过程中同步获取(图1)。NIPSS技术作为近年来我团队原创开发的新型通用测序方法(Yan et al., 2019),有别于现有纳米孔测序技术仅能测序基因组或转录组,NIPSS对任意可以通过孔道的单分子分析物均可实施直接测序。虽然现有NIPSS测序技术的读长仅有15个碱基(15 nt),但该读长与天然成熟miRNA的全长(22 nt)极为接近,具有实现测序检测的技术可行性,并在该工作中首次得到了技术验证。

1. NIPSS技术用于miRNA直接测序方法原理及信号展示

在该工作中,DNA-miRNA嵌合链被用做纳米孔测序的模板链(图2)。嵌合链可以通过使用T4 RNA连接酶连接待测miRNA 3端和DNA 5端来构建。在NIPSS测序过程中,DNA聚合酶合成DNA时,产生驱动力拉动嵌合链整体向cis侧移动,由于位差的存在,其连接的miRNA碱基逐个通过纳米孔识别位点,miRNA序列从而被纳米孔直接读取。原理上说,NIPSS技术的读长由聚合酶合成位点与纳米孔识别位点之间的位差决定,其长度等价于该工作中所使用的MspA纳米孔道的高度,亦对应于miRNA 3端的15个碱基。虽然该读长不足以完美覆盖miRNA的全长,基于对现有全部人类miRNA的生物信息学分析 (http://www.mirbase.org/) ,该读长足以直接区分99.5%的人类miRNA,已具备直接的应用性。作为概念验证,研究团队选择对几种与肿瘤关系密切的miRNA进行测序,包括致癌性miR-21和其变体miR-21+U (miR-21 3端单尿嘧啶添加产物),以及抑癌性let-7a。几种miRNA都给出了与各自序列相对应的特征测序信号。序列差异较大的miR-21let-7a,以及序列高度相似的miR-21miR-21+U,都实现了很好的区分。作为领域内的首个miRNA单分子测序方法,NIPSS技术展现了高的测序分辨率,这对其应用拓展,例如鉴定高序列相似度的miRNA家族成员或单碱基变异,具有直接的检测价值。

2. NIPSS测序链DNA-miRNA的酶连接构建原理及结果表征。其中胶图中标注为DNA-miRNA的明显条带为所构建的待测嵌合链

在进一步的研究中,研究团队探索了NIPSS技术表征miRNA上序列修饰的能力。M6A作为一种广受关注的RNA 表观遗传学修饰,常见于mRNA。最近的研究表明,m6A修饰也存在于miRNA,并且具有生物学功能。然而目前还没有方法能在miRNA序列中定位m6A。在该工作中,研究团队在miR-21序列中人工引入了单个m6A修饰碱基(图3)作为概念性验证,进而在NIPSS测序过程中观测到m6A产生的特异性测序信号。相比于经典碱基Am6A表现出更高的信号特征,从而能在miRNA序列中准确定位。相较于传统的二代测序技术,NIPSS技术在单分子水平获取miRNA序列的同时,序列修饰信息得以保留而被纳米孔直接探测,是目前对miRNA修饰信息进行直接单分子测序检测的唯一方法。

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3. NIPSS技术用于m6A修饰检测

此外,本团队近年来致力于开发基于纳米孔成像技术的低成本,高通量检测装置(Wang et al., 2019),未来有望与NIPSS测序技术相结合,实现高通量的miRNA单分子测序。

该工作以“Direct microRNA sequencing using Nanopore Induced Phase-shift SequencingNIPSS为题,发表在Cell Press旗下交叉学科期刊iScience(DOI: https://doi.org/10.1016/j.isci.2020.100916)。本团队博士生张金月和阎双红为该论文共同第一作者,黄硕教授为该论文通讯作者。此项研究得到了国家自然科学基金(项目编号:917531082167508331972917)、中央高校基本科研业务费(国际科技合作促进项目)(项目编号: 020514380142020514380174)、生命分析化学国家重点实验室(项目编号:5431ZZXM18045431ZZXM1902)、南京大学卓越计划 (项目编号:ZYJH004)、中组部青年千人计划、江苏省高层次创业创新人才引进计划和南京大学科技创新基金项目等经费支持。

 

文章标题: Direct microRNA sequencing using Nanopore Induced Phase-shift SequencingNIPSS),DOI: https://doi.org/10.1016/j.isci.2020.100916(点击此处直达文章链接

该论文作者为:Jinyue Zhang, Shuanghong Yan, Le Chang, Weiming Guo, Yuqin Wang, Yu Wang, Panke Zhang, Hong-Yuan Chen, Shuo Huang  

Address: Prof. Shuo Huang Room A220/A221 School of Chemistry & Chemical Engineering

Nanjing University 163 Xianlin Ave, Nanjing, China 210023

Email: shuo.huang@nju.edu.cn

TEL: 025-89681920(Lab)/89681921(Office)

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